近日，北京理工大学化学与化工学院吴彪教授、唐娟特别研究员和赵伟特别研究员在国际知名化学期刊《Angewandte Chemie International Edition》上发表题目为“A Neutral Single-Molecule Carrier for Delivery of Phosphonate Drugs”的研究论文。该论文的第一作者为北京理工大学博士研究生聂清玲。此项研究得到了国家自然科学基金，北京市自然科学基金和北京理工大学青年教师学术启动计划等项目的资助及北京理工大学分析测试中心的支持。

磷/膦酸基团是抗病毒、抗肿瘤及抗骨质疏松药物的关键活性基团，然而其高亲水性和多重负电荷特性严重阻碍该类药物的跨膜转运，导致生物利用度低（例如，临床使用的双膦酸盐的生物利用度仅为1%）。为提高磷/膦酸盐药物（PDs）疗效并减少其副作用，现有策略包括：（1）小分子酯化修饰，以增强亲脂性，但需要对药物分子逐一进行修饰；（2）纳米颗粒载体，虽具广泛的药物适应性，却存在载药量批次间差异大的问题而导致临床应用受限制。针对上述科学问题，亟待开发可通过明确结构实现明确的药物负载且具有广谱药物适应性的载体。单分子载体凭借分子级精准封装能力成为新兴解决方案。然而，具有水合能高、几何形状复杂的磷/膦酸药物与载体间有效结合是极具挑战性的。目前的研究仅有两例阳离子型环糊精衍生物作为分子载体通过静电作用结合三磷酸盐实现细胞水平的递送（ Sci. Rep. 2017, 7, 8353.； Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 9891-9895.）。

团队前期开发的三足六脲配体（ Chem. Sci . 2019, 10, 2483-2488; Chem. Commun . 2023, 59, 12923-12926.; Angew. Chem. Int. Ed . 2024, 63, e202403314.）通过12个预组织氢键结合磷酸盐物种，其常数（ K _a）高达 10⁶ M⁻¹。为了通过“笼效应”进一步提高结合亲和力，本研究设计了一种由两个六脲单元通过刚性苯基连接的中性笼状结构（cage 1）。该载体通过预组织的多重氢键与多种PDs（包括单磷酸盐、双膦酸盐及三磷酸盐）形成强效结合，并利用动态氢键特性实现水性环境中的可控释放（图1A）。晶体结构与功能验证表明，cage 1可自适应调整腔体构象以适配不同尺寸药物分子，进一步通过大胞饮内吞途径将药物高效递送至溶酶体，为克服传统递送难题提供了创新思路。

图1 cage1跨膜转运磷/膦酸盐药物示意图

以硫酸根离子为模板，三足三脲前体与1,4-亚苯基二异氰酸酯通过一锅法反应合成十二脲分子笼（cage 1）。单晶分析表明，cage 1与不同PDs以1:2结合（图1B），每个阴离子通过多重氢键稳定结合于六脲单元内。笼状结构的轴向高度及中间苯环形成的空腔可动态调整以适配不同尺寸阴离子。核磁共振（NMR）滴定分析显示（图2A），连续滴定PDs导致cage 1的NH质子产生显著低场位移，伴随复合物特征峰的出现，证明PDs与cage 1在NMR时间尺度下存在慢交换热力学结合机制。溶剂极性效应实验证实，水含量的梯度增加（从0.5%增加至20%（H₂O/DMSO- d ₆））显著削弱配合物主客体间的氢键相互作用（图2B），导致cage 1与PDs的结合常数呈现数量级递减：从10⁶ M⁻¹降至10⁴ M⁻¹。由此推演，纯水溶液中cage 1与PDs的结合常数将显著降低（<<10<>⁴ M⁻¹），再次验证cage 1在水环境中能够高效释放PDs。等温滴定量热法（ITC）测得的复合物1⋅PD的结合常数 K _a1为10⁶~ 10⁷ M⁻¹（图2C），与磷酸盐转运蛋白（ K _a = 10⁶ M⁻¹）相当，且不同PD底物间的结合常数差异极小，同样表明cage 1具有自适应阴离子结合特性。

图2 cage1与PD的结合

为评估cage 1对PDs的递送效果，本研究首先测试了cage 1对多种肿瘤细胞（如HeLa、HepG2、MDA-MB-231、PC-3和 4T1）的细胞毒性，即使在100 µM条件下，细胞存活率仍显著高于安全阈值，凸显其优异的生物相容性。本研究首先采用荧光标记的单磷酸盐、双膦酸盐（BPs）及三磷酸盐作为模型药物，通过共聚焦显微镜直观展示了复合物的胞内积累效果。结果显示，cage 1žPDs复合物处理的细胞其荧光强度较游离药物组显著增强了33~45倍（图3A, 3B），文献中带正电荷的环糊精递送的PD在MCF7细胞中的荧光强度只提高了5倍。抗肿瘤细胞增殖实验进一步证明，相比起游离的双膦酸盐，cage 1递送的双膦酸盐对肿瘤细胞对肿瘤细胞的增殖抑制效率提升2-4倍（图3C, 3D），且该效果在多种细胞系中均保持一致（图3E）。相较于与原药酯化（提高1.3倍）或非靶向单功能双膦酸盐纳米载体（效果忽略不计），cage 1展现更优越的递送效率。cage 1通过精准PD药物负载与可控释放，为改善磷/膦酸盐类药物的临床疗效提供了可靠依据。

图3. cage1在活细胞中递PDs的实验

本研究进一步探究了蛋白对cage 1递送PD的作用。首先，共聚焦成像（CLSM）分析显示，复合物的细胞摄取高度依赖血清蛋白（图4A, 4B）：在含胎牛血清（FBS）或BSA的培养基中，胞内荧光强度显著提升，而无蛋白条件下PDs的内化效率显著降低，表明蛋白冠通过疏水屏蔽作用维持PDs与cage 1的结合稳定性。动态光散射（DLS）研究表明，cage 1žPD复合物在含血清环境中形成~200 nm纳米聚集体（适配大胞饮途径）；而无血清条件下因缺乏蛋白冠保护导致聚集体尺寸增至~4.2 µm。荧光共振能量转移（FRET）分析进一步证实cage 1可介导血清白蛋白（BSA）与PDs形成稳定三元复合物，而游离PDs无此结合特性。最后，本研究深入探究了配合物的细胞内化机制。通过配合物内吞抑制实验结合透射电镜（TEM）（图4C）观察到的特征性细胞膜内陷及直径>500 nm的囊泡结构，确认大胞饮作用为其主要摄取途径。PDs与溶酶体共定位实验进一步揭示配合物经大胞饮内吞后靶向溶酶体/内体区室（图4D），PDs的释放过程与蛋白质冠解离及溶酶体酸化微环境存在协同作用（图4E）。体内分布实验证实cage 1žPD配合物通过增强渗透与滞留（EPR）效应实现肿瘤组织特异性积累，其肿瘤区域荧光强度较游离药物提升（图4F）。这种具有肿瘤选择性的递送方式可实现磷/膦酸盐类治疗药物（包括核苷酸类似物和寡聚核酸药物）的精确靶向，从而有效抑制肿瘤和进行联合治疗，推动精准肿瘤学的前沿发展。

图4 探索细胞摄取PD复合物的途径

综上所述，我们开发了一种中性阴离子受体（cage 1）作为单分子载体，基于阴离子配位策略成功解决了PDs的递送难题。cage 1与PD的结合亲和力达10⁶~10⁷ M⁻¹，与天然磷酸盐转运蛋白相当。cage 1递送的PDs通过大胞饮内吞途径进入细胞，并将药物输送到溶酶体，使细胞内的药物富集量增加33-45倍，并使PDs对肿瘤细胞的增殖抑制效果提高2-4倍。体内实验证实其可通过增强渗透与滞留（Enhanced Permeability and Retention effect，EPR）效应实现配合物在肿瘤部位选择性富集。该递送策略具有以下主要优势：（a）分子级封装，可精确装载药物；（b）cage 1使PDs亲水性和负电荷密度降低，易于穿透细胞；以及（c）主客体通过动态氢键结合，药物释放可控。该研究为设计电中性的单分子载体递送磷酸盐药物提供了新的思考方向。 

原文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202509002

附通讯作者简介：

吴彪，北京理工大学化学与化工学院教授，博导，国家级领军人才。现任医药分子科学与制剂工程工信部重点实验室主任。原创性地发展了“阴离子配位超分子组装化学”研究方向，在JACS，ACIE等国际知名高水平期刊发表学术论文200余篇，科研成果获省部级科学技术一等奖。研究方向为通过设计和合成阴离子配体、研究其配位性质，发展和完善阴离子配位化学理论，指导高级有序组装结构的精准构筑和功能控制。

唐娟，特别研究员，博导。2020年12月加入北京理工大学化学与化工学院，研究方向主要集中在化学与生命科学的交叉领域，旨在通过发展化学工具探测和调节生命过程，揭示生物事件的发生发展规律，为疾病的治疗提供新思路。包括：1）发展低能量光可活化荧光探针监测细胞通讯动力学；2）发展阴离子配体靶向性治疗癌症；3）发展不含重金属的光敏剂用于癌症的光动力治疗。主持国家自然科学基金青年项目，北理工青年教师学术启动计划和北京理工大学科技创新计划科研基地科技支撑专项计划。在国内外学术刊物上发表学术论文30余篇，包括 J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed.,  Chem. Sci. 等。

赵伟，特别研究员，博导。2020年7月加入北京理工大学化学与化工学院，从事阴离子配位作用相关的超分子化学研究，包括配体分子的理性设计、结构调控及其在离子分离纯化等领域的应用。主持国家自然科学基金、北京市自然科学基金和北理工青年教师学术启动计划。近年来，授权国家发明专利2项，在国内外学术刊物上发表学术论文40余篇，包括 Science, Chem, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., CCS Chemistry 等。